最近，我国有关专家突破了目前干细胞研究领域的一大难点，建立了一种高效诱导胚胎干细胞向肝细胞分化的培养体系，获得了更加接近于成熟肝细胞的胚胎干细胞源性肝细胞，并进一步证实这些细胞具有在体外合成并分泌凝血因子8、9的能力，有望为血友病替代疗法提供新型种子细胞来源，为干细胞移植治疗血友病的更深入研究奠定了坚实的实验基础。
血友病是目前临床上最常见的先天性凝血障碍性疾病。其最主要的发病机制是由于凝血因子8或/和9基因的突变或缺失，凝血因子8、9缺陷分别导致血友病A和B的发生。 血友病A也称甲型血友病，又名抗血友病球蛋白缺乏症(第8凝血因子缺乏）。主要表现为出血倾向。 血友病B又称为血浆凝血活酶成分缺乏症（第9凝血因子缺乏）。此型临床表现酷似A型，但发病率较低。两者的区别在于缺乏的东西不一样。血友病的严重程度与血液循环中凝血因子8、9蛋白的水平密切相关。替代治疗被认为是目前的标准治疗方法，但是重组或血浆来源的凝血因子8、9极易在血液循环中降解，并且其费用也非常昂贵。转基因技术虽然可以从根本上纠正凝血因子表达缺陷，但是基因表达效率低、维持时间短并引起免疫反应。肝脏是产生凝血因子2、5、 7、8、9 和10的器官，所以，凝血因子8和9缺陷是肝细胞替代治疗的适应证。但供体肝细胞匮乏、培养肝细胞增殖能力差，以及经过冻存的肝细胞活力低等关键问题一直难以得到有效地解决，限制了肝细胞的应用。
胚胎干细胞是从哺乳动物的囊胚内细胞群经体外培养并分离克隆出来的一种原始、高度未分化细胞。胚胎干细胞具有自我复制、更新和发育全能性并能产生后代的能力，在特定条件下可分化为人体200 多种细胞类型，所以可用于构建心、肝、肾等各种组织和器官的研究。越来越多的研究表明，胚胎干细胞由于其无限增殖能力和多向分化潜能，有望为细胞移植治疗各种难治性疾病提供新的细胞来源。目前诱导胚胎干细胞分化为肝细胞的研究已取得一定进展，但国际上关于胚胎干细胞源性肝细胞是否表达凝血因子的报道仍非常有限。如果可以成功建立一种共表达凝血因子8、9的胚胎干细胞源性肝细胞的培养体系，将有望为血友病A和B的细胞替代治疗提供充足的、新型“种子”细胞来源。
凝血因子8、9由成熟肝脏细胞合成并分泌，而高效诱导胚胎干细胞分化为功能性成熟肝细胞仍是目前干细胞研究领域的一大难点。研究人员建立了一种高效诱导胚胎干细胞向肝细胞分化的培养体系，通过表观遗传学修饰及多种诱导因子联合贯续应用，获得了更加接近于成熟肝细胞的胚胎干细胞源性肝细胞，并进一步证实所获得的胚胎干细胞源性肝细胞具有在体外合成并分泌凝血因子8、9的能力。
这篇研究发表在最新一期《中国药理学报》上，由中山大学附属孙逸仙纪念医院肝胆胰外科闵军教授、陈亚进教授以及曹君博士、商昌珍博士领导的研究小组完成，并获得国家863基金及国家自然基金资助。研究小组将组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠、骨形态发生蛋白4及碱性成纤维细胞生长因子联合作用，促使小鼠胚胎干细胞分化为内胚层细胞和肝脏前体细胞，分化后期在肝细胞生长因子、抑瘤素M和地塞米松作用下，肝脏前体细胞可以进一步分化为成熟肝脏细胞。研究人员同时通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、实时荧光定量聚合酶链反应（real-time PCR ） 蛋白质印迹法（western blot）、和流式细胞技术检测到凝血因子8、9在基因及蛋白水平的共表达。流式细胞技术分析结果显示凝血因子8、9双阳性的肝细胞比例达到70%以上，在作为对照的自发分化细胞中则无上述因子的表达。而经ELISA技术对细胞培养上清的检测，更是证实了此种由胚胎干细胞源性肝细胞所合成的凝血因子8、9能够成功地被分泌至细胞外。由此，该研究小组建立了一个新颖的诱导小鼠胚胎干细胞分化为稳定共表达凝血因子8、9的成熟肝细胞分化体系，并明确组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠与细胞因子BMP-4和bFGF对小鼠胚胎干细胞的肝系分化具有协同促进作用。在课题组开展的上述研究中，之所以能够获得高纯度的共表达凝血因子8、9的小鼠胚胎干细胞源性肝细胞，重要原因之一为诱导分化因子丁酸钠的作用。丁酸钠是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可以通过组蛋白修饰的方式使组蛋白超乙酰化，并激活一些转录因子，使其结合并激活某些基因，从而诱导细胞分化。
闵军教授和陈亚进教授的研究小组表示，该研究证实了共表达凝血因子8、9的胚胎干细胞源性肝细胞在血友病替代疗法中的潜在价值，所获得的更加接近于成熟肝细胞的功能性分化细胞将为细胞体内移植实验提供充足、安全的细胞来源，进一步为干细胞移植治疗血友病的更深入研究奠定坚实的实验基础。 |
