血友病治疗研究进展

添星

血友病(hemophilia)是一种x染色体连锁隐性遗传性疾病，由于编码凝血因子的基因异常导致凝血因子生成障碍。以阳性家族史、幼年发病、自发或轻度外伤后出血不止、血肿形成及关节出血为特征，通常男性发病、女性携带。包括血友病A(HA)、血友病B(HB)及遗传性因子Ⅺ缺乏症。血友病的社会人群发病率为(5—10)／10万，婴儿发生率约1／5000。血友病的治疗迄今仍以替代疗法为主。近年来，药物辅助治疗有许多报道，基因治疗的研究有突破性进展。现介绍如下
1替代疗法
1．1新鲜冰冻血浆新鲜冰冻血浆一般只在因子Ⅷ(FⅧ)缺乏时使用。由于用量过大易导致血容量过多，成人一次最大用量为20m1／kg。其不足之处在于：即使输入了大量的血浆，患者体内的FV$活性(FⅧ：C)最多只能升高达正常人的20％左右，无法发挥有效的止血作用。
1．2冷沉淀冷沉淀所含的FⅧ：C较新鲜血浆高5—10倍。其主要优点是制备及应用简单，价值低廉；其不足之处在于冷沉淀中含有少量红细胞及红细胞碎片，这些物质易引起抗原一抗体反应，约12％的患者经冷沉淀治疗后生成血型抗体。此外，由于工艺上的缺陷，冷沉淀中病毒未被灭活，使接受治疗者有感染病毒性疾病的危险。
1．3基因工程生产的FV$目前主要有两种重组的FV$产品。一种是由中华仓鼠卵巢细胞共同表达FV$和vwF，通过免疫亲和层析除去vWF后制得；另一种是由人FⅧ的cDNA转染幼小仓鼠的。肾脏细胞，分泌的FV$通过离子交换层析和鼠单抗免疫层析制得。重组的Fvm无论在生物化学、临床特征还是药代动力学方面，与血浆来源的FV$均非常相似，其活性大于5000u／mg。基因工程技术生产的FV$安全、有效，缺点是价格较高，无法为一般患者所接受。至于输注后能否使患者产生抗体，尚有待于进一步研究。
1．4动物的FⅧ制剂当人血来源的FⅧ制剂不能满足需要时，人们开始考虑FVm的其他来源并对数种动物的血浆进行了研究。目前已有商品化的猪及牛的FⅧ出售。猪及牛FⅧ冻干制剂的活性可达人血浆的100倍。这些动物来源的制剂不仅可以安全的输注给患者，在大手术时亦提供了满意的止血作用。更为重要的是动物的FV$可以作用于人的抗FⅧ抗体，使抗体的效价下降，因此可用于治疗伴抗体形成的患者。然而，动物蛋白质具有抗原性，在输注lO一12d以后，由于抗体产生使疗效下降。此外，这些制剂中因含有血小板凝集素及动物的vwF，可以直接作用于人类血小板，输注后可以引起血小板减少。由于在输注时可发生严重的过敏反应，所以在用前应做皮试。
1．5重组人活化因子VI(rhFVIIa)制剂高剂量FVIIa可能通过两种机制纠正出血。一是在足够的剂量时，FVIIa直接与活化血小板表面带负电荷的磷脂结合，进而活化FX。在血小板表面，FXa催化产生足量的凝血酶，促进纤维蛋白形成。另外一条可能的机制是高剂量的FVIIa可以与来自患者的FVI酶原有效竞争，使局部有更多的FVIIa—TF复合物形成，该处凝血酶得以大量产生。rhFVIIa制剂应用剂量以90计算，每2h应用1次。该药也是治疗抗FV$抗体的有效制剂。
1．6凝血酶原复合物浓缩剂(PCC)PCC除含有因子IX(FⅨ)外，尚有因子Ⅱ、Ⅶ、X等成分。PCC治疗血友病并不十分理想，因其含有多种其他凝血因子，有增加发生血栓栓塞的危险。
1．7高纯度FIX制剂高纯度FⅨ制剂经层析法纯化，去除了其他凝血因子，每毫克蛋白质成分含有FIX活性(FIX：C)相当于50～200U。许多研究证实，高纯度FIX制剂疗效高，无血栓危险，不带病毒，是迄今治疗血友病的较佳选择。
2药物辅助治疗
近年来，药物治疗血友病有许多新发现。这些方法不仅丰富了血友病治疗的内容，又拓展了血友病替代疗法以外的辅助疗法以及对轻、中型患者预防和治疗出血的手段。

2．1雷尼替丁
雷尼替丁是一种选择性H受体拮抗药，可竞争性阻断组胺与胃黏膜壁细胞上的H受体结合，有效的抑制基础胃酸分泌及由组胺、五肽胃泌素和食物刺激后引起的胃酸分泌，降低胃酶的活性。胡理明⋯报道，雷尼替丁治疗血友病2O例(0．15，bid，疗程半月)，患者黏膜出血停止、血肿吸收，FⅧ：C及FIX：C水平明显增高，活化的部分凝血活酶时间(a肿)明显缩短。雷尼替丁对轻、中、重型血友病均有效果，未发现不良反应，其机制尚待进一步研究。2．2去氨加压素(DDAVP)
DDAVP是一种人工合成的加压素衍生物，有抗利尿作用。DDAVP可促进内皮细胞等释放FⅧ，增加FⅧ的血浆水平'，或因促进vWF释放而增加FⅧ的稳定性，致FV$：C升高。余自强等以DDAVP治疗17例血友病，14例轻、中型患者出血症状明显减轻或消失，FⅧ：C水平均值上升约6倍，均达到临床止血所需浓度。DDAVP常用于轻型血友病和FⅧ：C较低的血友病基因携带者，其剂量为0．3—0．5kg静脉滴注，还可经鼻腔滴入，剂量应是静脉给药量的1O倍。DDAVP若与抗纤溶药物同时应用，效果可以增加，但反复用药后可致FⅧ反应下降，疗效减低。

2．3达那唑
达那唑是一种人工合成的雄激素，具有弱雄激素活性，可用于轻、中型血友病的治疗。一项随机双盲对照试验对达那唑治疗HA的疗效进行了评价。试验选择19例血友病患者，分别给予达那唑150mg／d(<15岁)及300mg／d(≥15岁)。结果显示，部分轻、中型患者治疗后的FV$水平较治疗前有显著提高，发生出血的频率明显减低。治疗过程中没有观察到明显的副作用。
2．4抗纤溶药物
抗纤溶药物可用于轻型血友病患者，亦可与替代疗法合并使用，以减少FⅧ和FIX制品的用量。此类药物对口腔、舌、扁桃体、咽喉部的出血及拔牙引起的出血有效，但对关节腔、深部肌肉和内脏出血疗效较差，在血尿、休克、肾功能不全出现时一般不主张常规使用。
2．5卡洛柳钠
卡洛柳钠为肾上腺素氧化产物肾上腺色素的缩氨脲，能增强毛细血管对损伤的抵抗力，稳定血管及其周围组织中的酸性黏多糖，降低毛细血管的通透性，增强受损毛细血管的收缩作用，从而缩短止血时间。卡洛柳钠对关节腔、肌肉出血和手术出血有效，静脉滴注效果更佳，但所形成的血凝块坚硬，吸收甚慢，对泌尿道和脑出血患者应慎用。

3脾细胞移植、脾移植
脾脏可以合成FⅧ，故脾细胞移植、脾移植可以治疗血友病。
1994年，Liu等报告以死亡者之脾制成脾细胞悬液用于治疗血友病2O例，取得了一定的疗效。2O例中有18例FⅧ：c增加，14例FⅧ：C从O％一3％升至10％一15％，4例FⅧ：C>15％。通常在移植后第4—7天FⅧ：C开始上升，可持续到22～58周。2例患者先前有间歇性血尿，移植后2年内无血尿复发。国内1998年开始至今已有多组脾脏移植治疗HA的报道。同济医科大学曾报道亲属脾移植治疗血友病4例长期存活的追踪观察。4例患者年龄9—15岁，均为重型血友病，FⅧ：C<1％，治疗前有反复出血史及关节畸形。供者为患者父母亲，FⅧ：C水平>70％。移植术后第3天起患者FⅧ：C水平开始上升，最高达58．7％，以后有所下降，至1年时波动在10％左右。1例1年后脾功能消失；1例脾功能保持了4年，ChineseJournalofThrombosisandHe堕堡术后3．5年时FⅧ：C6％；1例脾功能已保持2年；另1例移植后1．5年，脾功能良好，FⅧ：Cl1．3％。

4基因治疗
基因治疗是将有功能的正常基因转移到患者体内以替代有缺陷的基因，从而获取治疗效果，为治疗血友病开辟了一条新的途径。
4．1转基因载体基因治疗成功的关键之一是合成有效的载体，载体所表达的凝血因子能达到并保持治疗水平。目前用于血友病基因治疗研究的载体有病毒和非病毒载体，其中病毒载体主要有腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体，非病毒载体主要有脂质体、可移植的微胶囊等，有人尝试DNA蛋白复合体或裸露的DNA直接注射。
4．1．1腺病毒载体(adenovirusvectors，rAV)第1代和第2代的rAV均能表达止血水平的FVI和FIX。rAV能最有效的将外源基因导入机体的靶细胞中。Connelly等利用构建的含B区缺失的FⅧeDNA腺病毒载体，从小鼠尾静脉注射1周后，FⅧ表达水平平均高达300~g／L，这种高表达持续数周之久，并具有生物学活性。随后他们构建了第2代rAV，予成年小鼠以4倍于人治疗范围的剂量尾静脉注射后，FⅧ表达水平高达1046±163L，且持续5个多月。腺病毒载体容易引起宿主的免疫反应，从而使载体的反复输注受到限制；此外，直接针对载体的细胞毒T细胞反应会降低细胞转化效率。新构建的腺病毒载体，对腺病毒载体进行了剪辑处理，减少了免疫反应，但表达下降。

4．1．2腺相关病毒载体(adeno一一associatedvirusvector，rAAV)rAAV由腺相关病毒合成，是一种非致病单螺旋DNA细小病毒，可以整合到宿主基因组的特定部位中。rAAV能感染分裂和非分裂的细胞，不引起对转染细胞的淋巴细胞毒性反应，因此近年成为关注热点。使用rAAV在基因敲除血友病小鼠和狗的模型中均能表达治疗水平的FⅨ。用rAAV将人FⅨ转导至HB小鼠的肝脏，小鼠血浆人FⅨ表达浓度为正常的25％。小鼠正常凝血达17个月，未发现相关的毒性反应。将带有狗的FIXcDNA的rAAV注入HB小鼠体内，也得到了同样的结果，FIX表达量为20mg／L，并持续了2O周，aPTr得到纠正。与人类FⅧ结构相当的FⅧeDNAAAV载体(B区缺失和完整蛋白溶解部位)已构建成功，该载体高水平表达FV$并具有功能活性12J，AAV得到持续表达而无免疫反应，不引起细胞毒T细胞反应，多种靶细胞能释放凝血因子，动物模型已获成功。但其缺点是滴度低，费用高，不能大量扩增。4．1．3逆转录病毒载体(retroviralvectors，RV)RV是由逆转录病毒构建而成。RV用于血友病基因治疗的不足在于载体转化低和FⅧ表达低，但目前这些缺点已有所改进。质粒载体转染或RV转导的狗骨髓基质细胞(BMSCs)均能将人类FⅨ释放到狗的体循环，但RV转化的BMSCs较质粒转染的BMSCs表达人类FⅧ高出至少5倍，含B区缺失和完整蛋白溶解部位人类FⅧ逆转录病毒载体转化的BMSCs，较缺乏完整蛋白溶解部位人类FⅧ逆转录病毒载体转化的BMSCs表达更高水平的FⅧ。这些结果提示，只要对转基因的结构操纵合理，Rv确实能表达高水平的凝血因子。4．1．4非病毒载体非病毒载体比较病毒载体而言，其免疫原性要小得多。而且，因为从载体体系上去除了病毒成分。叉可以大大消除患者对病毒感染的忧虑。目前最有效的非病毒基因转移体系是DNA与去唾液酸糖蛋白偶联，再与肝细胞上的特异受体结合并进入，但是体内表达的时间很短。近年来非病毒载体如脂质体、微胶囊等也得到了开发和利用。另一种手段是使用载有目的基因和促进转基因成分的裸DNA质粒整合到基因组，初步的结果令人鼓舞。目前的非病毒载体也存在转化效率低，表达不稳定的问题。

4．2基因治疗的靶细胞肝细胞、骨髓基质细胞、内皮细胞、肠上皮细胞为实验中常用的几种载体靶细胞。由于肝脏是FⅧ／FⅨ的自然合成部位，在动物实验中，可从外周静脉直接注射载体，操作较为方便，因此有理由被选择作为靶细胞。肝细胞为非分裂细胞，妨碍了象逆转录病毒这类载体的利用。若将目的基因及载体直接导人，必需切除部分肝脏或用药物刺激肝细胞增生，而体外处理后再植入也十分困难。用肝细胞作靶细胞尚存在较多困难，但只要提高效率，肝细胞似乎是合理的靶细胞类型。骨髓基质细胞来源方便，但作为靶细胞仍有争议。体外实验中，骨髓基质细胞能产生治疗水平的FⅧ。用含B区缺失FⅧ的逆转录病毒载体转化骨髓基质细胞，将转化的细胞输入小鼠动物模型，产生高于治疗水平的凝血因子，因为动物模型的FⅧ不能持续表达，初步结果令人失望。由于载体可通过消化道摄入，因此肠上皮细胞可作为一种有效的靶细胞。肠上皮细胞分化迅速且分布，泛，对于含B区缺失FⅧ的逆转录病毒载体，是一种理想的靶细胞。实验显示，不仅FⅧ能达到治疗水平，而且该细胞能将FⅧ分泌到血循环而不分泌到胃内¨。内皮细胞直接与血液接触，还拥有能储存vWF的细胞器，也是FⅧ的储存部位，似乎是最佳的侯选靶细胞。内皮细胞为增殖型细胞，体外实验中，将含B区缺失FⅧ的逆转录病毒载体用于该细胞，FⅧ：C能达到正常血浆水平的80％，且输注简单。也有研究显示肌肉细胞的有利的结果。对其它细胞如成纤维细胞、骨髓造血干细胞、淋巴细胞等进行的研究，其结果不尽人意。